Диагностика хламидиоза у животных

Постановка окончательного диагноза на инфекционные болезни невозможна без обнаружения ее возбудителя.

Лабораторная диагностика хламидиоза в повседневной практике ветеринарной клиники

В настоящее время для лабораторной диагностики хламидиоза у животных применяют морфологические, иммунологические, вирусологические, молекулярно-генетический и серологические методы в соответствии с «Методическими указаниями по лабораторной диагностике хламидийных инфекций у животных», утвержденных Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 30 июня 1999 г №13-7-2/643, в соответствии с которыми в ветеринарную лабораторию для исследования необходимо направлять:

• сыворотку крови в количестве 3-5 см3 от абортировавших или подозрительных по заболеванию животных, а также во всех случаях, предусмотренных действующей инструкцией. Кровь от абортировавших животных берут дважды: в период клинического проявления болезни и повторно, от них же, через 14-21 день. Сыворотки направляют в лабораторию в количестве 1-2 см3;
• патологический  материал (соскобы с конъюнктивы, гениталий, фекалии берут только одноразовыми или стерильными инструментами в одноразовые пластиковые пробирки с крышками или в стерильные пробирки (флаконы) с резиновыми пробками с физраствором в количестве 1 см3 и доставляют в лабораторию в емкости со льдом в течение 24 часов.  Хранить материал можно не более 7 суток при 4 оС и 10-12 мес при температуре минус 20 оС;
• пробы эякулята или замороженной спермы, полученные от производителей, подозрительных по заболеванию. Пробы эякулята направляют для исследования в количестве 1 см3; замороженную сперму в количестве не менее 2 гранул доставляют в лабораторию в контейнере с жидким азотом или в пробирке с сухим льдом;
• патологический материал от павших или убитых больных животных (кусочки паренхиматозных органов, лимфатических узлов и семенников), от абортировавших животных (кусочки плаценты);
• абортированные плоды целиком или паренхиматозные органы и сычуг плода.

Патологический материал отбирают в стерильные, герметически закрывающиеся флаконы не позднее двух часов после гибели, убоя животного или аборта.

 Флаконы с патматериалом помещают в термос со льдом, а абортированные плоды во влагонепроницаемую тару и в тот же день, но не позже 24 часов, доставляют в лабораторию с соблюдением мер, исключающих распространение возбудителя инфекции.

Данные о существующих методах диагностики хламидиозов, используемом материале и продолжительности исследования приведены в таблице.

Диагноз на хламидийные инфекции считают предварительным при выявлении специфических антител в сыворотке крови в РСК (РДСК) или ИФА. Диагноз на хламидийные инфекции считают окончательным при применении любого прямого метода диагностики, который выявляет хламидии, антигены хламидий или ДНК хламидий в исследуемом материале.
Не рекомендуем применять световую микроскопия хламидиоза в связи с высоким процентом ложноположительных результатов, причиной которых является наличие другой микрофлоры. Эта методика обладает недостаточной специфичностью, особенно в случаях малой распространенности возбудителя в слизистых.

Материал для исследования направляем в ГУ «Санкт-Петербургская городская ветеринарная лаборатория», где используют диагностический тест «ХламиОрн» для идентификации родоспецифического антигена хламидий методом прямой иммунофлуоресценции в клиническом материале от больных животных. Реакция прямой иммунофлюоресценции основана на взаимодействии моноклональных антител с родоспецифическим хламидийным антигеном, результатом которого является специфическое ярко-зеленое свечение. Результат реакции оценивают визуально при помощи люминисцентного микроскопа.

Считаем, что тест «ХламиОрн» имеет следующие преимущества перед другими методами исследования:

1.  быстрота – вся диагностическая процедура с использованием моноклональных антител в среднем от момента забора материала до постановки диагноза занимает не более 40 мин.;
2. возможность интерпретации результатов на основе регистрации элементарных и ретикулярных телец, расположенных внутри- и внеклеточно при сохранении высокой степени чувствительности и специфичности;
3. относительная проста техники проведения анализа.

Однако этот метод дает в ряде случаев ложноотрицательные результаты, связанные с неправильной техникой забора образцов для исследования и с диагностикой хронических и вялотекущих форм хламидиоза, когда возбудитель, прячась от антител и антибиотиков уходит в подслизистый слой, где вокруг него начинает формироваться воспалительный вал из нейтрофилов и возбудитель оказывается внутри инкапсулированного пространства.

Отбор материала – один из самых ответственных этапов диагностики хламидиоза. Правильный отбор материала это задача ветеринарного врача в клинике, а дальнейшая обработка материала осуществляется в лаборатории. Мазки готовят непосредственно после взятия материала с конъюнктивы и гениталий животных, используя одноразовый зонд, имеющий ватный тампон с повышенной адсорбцией. Материал отбирают вращательным движением тампона и переносят в лунку предметного стекла. Предметное стекло заранее маркируют. Приготовленный мазок высушивают на воздухе. Высушенный мазок фиксируют в 96% этаноле в течение 5 минут или наносят на мазок 2-3 капли ацетона до полного его испарения. Фиксированный препарат может храниться при температуре 18-20 градусов С в течение 5 суток.

Ложноположительные результаты возможны при наличии в образце нежизнеспособных возбудителей или их антигенных структур, а также других бактерий, имеющих перекрестно-реагирующие антигены с антигенами хламидий. Следующей причиной, которая может привести к ошибке, является наличие острого воспалительного процесса на слизистой, когда за счет большого количества лейкоцитов и белка ИФА дает ложноположительные результаты.

Сегодня одним из наиболее перспективных подходов к прямой диагностике инфекций считают специфическую амплификацию нуклеиновых кислот in vitro и, в частности, наиболее разработанный вариант такой амплификации – метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющий в пробирке всего за несколько часов произвести изолированное умножение (амплификацию) любого гена или его фрагмента во много миллионов раз (Обухов И.Л. и др., 1996).

ПЦР, являясь самым чувствительным на сегодняшний день методом прямого обнаружения хламидий, не требует иммунологического ответа на проникновение возбудителя в организм хозяина, что дает возможность следить за ранними стадиями развития инфекции.

Для выявления патогенных микроорганизмов методом ПЦР не требуется их размножения, следовательно, так можно диагностировать инфекцию в латентной стадии. Необходимо также отметить простоту отбора материала для проведения ПЦР-диагностики на хламидиоз, т.к. можно достоверно судить об инфицированности животного по исследованию соскобов с конъюнктивы или слизистых урогенитального тракта. Клинический материал для ПЦР отбирают в пробирки с буферным раствором.

На сегодняшний день производятся тест-системы для выявления хламидий методом ПЦР, которые обладают 100% специфичностью и чувствительностью 10 копий ДНК на 1 мл образца (Обухов И.Л., 1994). Таким образом, ПЦР превосходит все биохимические и иммуноферментные методы лабораторной диагностики инфекций, в частности хламидиоза, т.к. позволяет определять единичные копии инфекционного возбудителя в исследуемом образце клинического материала.

В ГУ «Санкт-Петербургская городская ветеринарная лаборатория» применяют тест-систему «Хлаком» для диагностики хламидиоза животных и птиц путем выявления в биологическом материале ДНК микроорганизмов семейства Chlamydiaceae.

Диагностическая чувствительность и специфичность ПЦР зачастую превосходит культуральный метод, называемым «золотым стандартом» для выделения хламидий. Тем более, если учесть продолжительность процедуры выращивания культуры клеток (до нескольких недель) и опасность инфицирования персонала лаборатории, то преимущество метода ПЦР становится несомненным, т.к. ПЦР-анализ проводится в течение 4-5 часов и для его проведения используется любой материал.

Высокая чувствительность ПЦР становится недостатком, когда при исследовании животных после курса лечения появляются ложноположительные результаты в связи с невозможностью оценить жизнеспособность и патогенность клетки только на основании выявления фрагмента ее генома.

В связи с вышеизложенным, рекомендуем для лабораторной диагностики хламидиозов отбирать материал и направлять его для исследования, используя ИФА + ПЦР, а для контроля результатов лечения после курса терапии – ИФА.